계산적 방법을 활용한

단백질 치료제의 면역원성 제거

(Protein deimmunization)

 

 

 

 

 

최 윤 주   연구조교수 

(KAIST 생명과학과)



 

 

 

항체를 비롯한 단백질 치료제는 다양한 질병을 치료하기 위한 차세대 치료기술로 주목받고 있다. 하지만 단백질 치료제 등 생물제제(Biologics) 개발엔 다양한 위험과 도전 과제들이 존재하는데, 특히 인체 내의 방어기제, 즉 면역 반응은 치료약의 효험을 저해하거나 과민증에 의한 쇼크 등 다양한 문제를 불러일으킬 수 있다.1 따라서 면역원성(immunogenicity) 완화 및 제거는 단백질 치료제 개발 시 매우 중요한 고려 사안이라고 할 수 있다.

 

 

 

면역 방어 기제: B 세포와 T 세포

 

인간의 면역체계는 박테리아, 바이러스, 기생충 등 다양한 외부에서의 침입으로부터 보호하기 위해 복잡한 방어 기제로 구성되어 있다. 단백질 치료제가 인체 내에 투여되어 외부 물질로 인식되는 과정에서 면역원성을 일으키는 부분을 에피토프(epitope)”라고 부른다. 면역 세포 중 B 세포는 세포 표면의 수용기를 통해 외부 물질의 겉표면을 감지하고 (그림 1A), 외부 물질로 인식할 경우 일정 기간의 성숙 과정을 거쳐 에피토프에 높은 결합력을 가진 항체(antibody)를 분비해 중화시켜 체외로 배출시킨다.

 

박테리아나 바이러스는 숙주와 유사한 표면을 가진 단백질을 만들어 숙주 세포에 침투하거나 숙주의 면역 감시망을 피하기도한다 (molecular mimicry). 따라서 B 세포에 의한 겉표면 검사 이외에도 면역체계는 좀 더 정밀한 감식 체계를 동원하기도 하는데, 일부 면역 세포는 전문적으로 외부 물질 조각을 세포 표면에 게시해(antigen presentation) 다른 면역 세포의 연쇄 반응을 유도한다. 대식세포(macrophage)와 수지상세포(dendritic cell) 등이 그 종류로, 치료제를 세포 내로 흡수한 뒤 내부에서 단백질 가수분해(proteolysis)를 통해 단백질을 조각낸다. 조각난 단백질은 세포 표면에 대조직적합성복합체(Major Histocompatibility Complex: MHC) 분자에 게시되어 T 세포의 검사를 받는다. T 세포 에피토프는 T 세포를 활성화하는 단백질 조각 펩타이드(peptide)를 지칭하며 (그림 1B), 활성화된 T 세포는 B 세포의 성숙화를 가동해 항체를 생산하게 만든다.

 

 

1. T 세포와 B 세포 에피토프의 감지 기작. 에피토프는 붉은 색으로 표시. (A) 흰색 구조는 인간 인터류킨 18, 하단의 구조는 쥐 항체. 항체 및 B 세포 수용체는 단백질의 표면을 감지하여 외부물질여부를 판단한다 (PDB ID: 2VXT). (B) 흰색 구조는 MHC 분자, 상단의 구조는 T 세포 수용체. 가수분해로 조각난 단백질 펩타이드가 MHC 분자에 게시되어 T 세포 수용체에 의해 외부 물질 여부를 감지한다 (PDB ID: 4MS8).

 

 

 

면역원성 제거를 위한 실험적 접근

 

에피토프 확인과 제거를 위해 가장 널리 쓰이는 실험적 접근법은 단백질 서열을 작은 크기의 알라닌 아미노산으로 돌연변이 시키는 알라닌 스캐닝(alanine scanning)과 시행착오 돌연변이(trial and error mutagenesis) 등이 있다. 특히 치료 단백질의 B 세포 에피토프 제거에 활용되어 왔으며, 겉표면을 친수성(hydrophilic) 아미노산으로 교체하거나 무작위 돌연변이를 도입해 고속 대량 스크리닝(high-throughput screening)으로 B 세포 에피토프가 제거된 단백질을 선별하기도 한다.

 

인체의 면역 체계를 회피하기 위한 또 다른 실험 기법은 단백질 치료제에 일종의 분자 갑옷을 입히는 것이다. 이 갑옷의 재질은 면역체계가 유해하지 않다고 인식하는 물질이 사용되며, 단백질 치료제에 화학적으로 결합시켜 생체에 투여한다. 폴리에틸렌글리콜(PolyEthylene Glycol: PEG)을 활용한 PEGylation2이나 친수성 높은 자연 아미노산 서열을 활용한 XTENylation3 등이 그 예로, 면역원성을 낮출 뿐만 아니라 체내 잔류 시간도 높여주지만, 에피토프에 특이적이지 않고 약의 활동성이 일반적으로 저하된다는 단점이 있다.4

 

 

 

계산 방법을 통한 T 세포 에피토프 예측

 

MHC에는 I형과 II형으로 구분되어 있고, 무수히 많은 병원체에 대항하기 위해 가장 많은 동질이형(polymorphic)을 가진 유전자로 알려져 있다.5 T 세포 에피토프에서 MHC와 직접적으로 상호 작용하는 펩타이드는 일반적으로 9개의 아미노산으로 구성되어 있다. 9개 아미노산을 통한 정보 조합은 자신(self)”자신(non-self)”을 구분하기 위한 최적화된 수로, 인간 9개 아미노산 펩타이드 전체와 바이러스/박테리아의 조각이 동일할 확률은 0.2% 정도이다.6

 

MHC 분자의 종류와 9개 아미노산 펩타이드 전체를 모두 고려했을 경우 천문학적인 조합이 가능하므로 실험적으로 이 가능성을 검사하기는 거의 불가능에 가깝다. 다만, MHC 분자에 결합하는 펩타이드는 무작위가 아니며 특정한 통계적 패턴을 보이는데, 예를 들어 펩타이드의 말단은 소수성(hydrophobic) 아미노산이나 염기성(basic) 아미노산이 주로 나타난다.7 최근에는 축적된 실험 데이터를 기반으로 한 기계학습(machine learning)을 통해 펩타이드의 MHC 결합 여부를 생물정보학(bioinformatics) 방법으로 예측하는 기술이 개발되고 있다.8

 

 

 

T 세포 에피토프 제거를 통한 기능적 면역원성 제거

 

단일클론항체(monoclonal antibody)는 현재 제약시장을 이끌고 있는 단백질 치료제로, 쥐 등에 항원체(antigen)를 투여해 면역법(immunization)을 통해 얻거나 파지와 효모 디스플레이(phage/yeast displays)를 만들어 얻기도 한다. 특히 면역법을 통해 얻은 항체는 인간 유래가 아니기에 면역 반응을 유발한다. 항체의 면역원성은 인간 항체에 기능과 관계없는 부분을 이식하는 방식으로 조절한다 (항체 인간화: antibody humanization). 인간 항체 부분 비율과 임상에서의 면역원성 간에 높은 상관관계가 있다는 게 알려져 있다.9

 

자연계에는 항체처럼 인간에 대응짝은 없지만, 잠재적으로 인간에게 유용하며 치료용으로도 쓰일 수 있는 단백질이 많이 존재한다. 황색 포도 상구균(Staphylococcus aureus)에서 유래한 스타필로키나아제(Staphylokinase; SAKSTAR)는 심근경색 치료에 효과적임이 알려져 있고, 초창기 면역원성 제거 연구 대상이었다.10 이외에도 항암치료용 효소로 사용되는 베타-락타마아제(beta-lactamase)11, 그리고 최근 표적 항암 치료제로 주목 받는 재조합형 항체 독소(recombinant immunotoxin)12 등이 그 예이다. 또한 에리스로포이에틴(erythropoietin)13, 인터페론 베타(Interferon β)14 등 인간 유래이면서도 면역원성이 알려진 단백질도 존재한다.

 

이러한 인간 대응짝이 없는 단백질의 면역원성은 T 세포 에피토프 제거를 통해 조절한다. , 돌연변이의 도입으로 T 세포 에피토프를 없애 MHC 분자에 게시되는 걸 막고, 궁극적으로 면역 반응을 회피하는 접근법이다. T 세포 에피토프가 될 부분을 예측하기 위해 생명정보학 방법이 적극 활용되고 있으며, 급성 백혈병 치료제로 쓰이고 있는 아스피라기나아제(asparaginase)의 면역원성을 예측 및 제거하는 데 성공하였다.15 최근에는 구조 정보를 활용한 단백질 재설계 기술과 T 세포 에피토프 예측을 결합해 응용하고 있다. 이러한 접근법으로 개발된 중피종(mesothelioma)B-세포 종양 치료를 위한 재조합형 항체 독소는 임상 시험에 들어가 있으며, 항생제 저항 황색포도상구균(MRSA: Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus) 감염 치료제인 라이소스타핀(lysostaphin) 연구는 계산으로 예측된 T 세포 에피토프를 완전 제거할 경우 면역 체계가 반응하지 않는다는 걸 보였다 (그림 2).16

 

 

그림 2. 계산적 방법을 이용한 라이소스타핀(lysostaphin) T 세포 에피토프 제거. 항생제 저항 황색포도상구균(MRSA) 치료제인 라이소스타핀 단백질에서 T 세포 에피토프가 될 부분을 컴퓨터로 예측하고, 단백질 재설계 기술을 활용해 에피토프가 제거된 라이소스타핀 변종을 제작하였다. 하단의 붉은 색은 T 세포 에피토프를 나타낸다 (붉을수록 면역원성이 더 높다고 예측되는 에피토프).

 

 

 

T 세포 에피토프 제거를 통한 면역원성 제거법의 한계와 전망

 

계산 방법을 통한 T 세포 에피토프 제거 기술이 다양한 단백질을 대상으로 성공적인 결과를 보여줬음에도 불구하고 명백한 한계점 역시 존재한다. 기계학습을 통한 예측력은 데이터의 양과 질에 의해 결정된다. 면역 에피토프 데이터베이스(IEDB: Immune Epitope Database)17에 등록된 MHC 결합력 결과가 백만 건이 넘어감에도 불구하고 거의 무한에 가까운 MHC-펩타이드 결합 조합을 완전히 대표하긴 어려우며, 드문 형태의 MHC의 경우에는 높은 예측력을 기대하기 어렵다. 예측의 통계적 신뢰성도 문제가 된다. 현재 널리 통용되는 계산 방법은 T 세포 에피토프 예측력이 통계적 신뢰도가 아주 높지 않다.18 T 세포 에피토프가 아니라고 예측된 펩타이드는 거의 확실하게 아니라고 할 수 있지만, 맞다고 예측된 경우의 신뢰도는 높지 않다.

 

T 세포 에피토프 제거법은 안정성에 악영향을 주기도 한다. 에피토프 제거엔 다량의 돌연변이가 요구되며, 앞서 기술한 것처럼 T 세포 에피토프는 통계적으로 소수성/염기성 아미노산으로 구성되었을 가능성이 높다. 단백질은 소수성 단백질이 중심부를 이뤄 3차원 구조로 접힌다. 에피토프 제거를 위해선 돌연변이로 친수성/산성(acidic) 아미노산이 요구되는데, T 세포 에피토프에 돌연변이를 줄 경우 단백질의 중심부를 변형할 가능성이 높다. 그러므로 단백질 안정성에 치명적인 영향을 끼칠 가능성이 있어 다량의 돌연변이를 도입하기 어려우며, 따라서 T 세포 에피토프의 제거량 자체에 한계가 있다.

 

극복해야 할 문제점이 있음에도 T 세포 에피토프 제거 면역원성 조절은 궁극적으로 비항체 단백질 치료제의 면역원성을 제거할 수 있는 거의 유일한 대안으로, 면역제거 기술이 본격적으로 활용되면서 이전에 치료제로 사용할 수 없었던 단백질의 외연을 넓힐 수 있게 되었다.19 이 기술은 특히 항체 개발 기술과 결합하여 더 강력한 도구가 될 수 있다. 현재 가장 성공적인 치료 항체인 Humira의 경우 인간 항체 골격을 기반으로 개발되었음에도 불구하고 인간 부분으로 교체 불가능한 항체결합 부위의 T 세포 에피토프로 인해 면역원성이 나타난다.20 T 세포 에피토프 제거 기술법은 항체 바이오시밀러 및 바이오베터 개발에 널리 사용될 수 있는 기술이며, 환자 면역 체계 맞춤형 치료제21Cas9 등을 활용한 유전자 치료(gene therapy)22 등에도 폭넓게 응용될 수 있다.

 

 

 

참고문헌

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2. Turecek, P. L.; Bossard, M. J.; Schoetens, F.; Ivens, I. A., PEGylation of biopharmaceuticals: a review of chemistry and nonclinical safety information of approved drugs. Journal of pharmaceutical sciences 2016, 105 (2), 460-475.

3. Podust, V. N.; Balan, S.; Sim, B.-C.; Coyle, M. P.; Ernst, U.; Peters, R. T.; Schellenberger, V., Extension of in vivo half-life of biologically active molecules by XTEN protein polymers. Journal of Controlled Release 2016, 240, 52-66.

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12. Mazor, R.; Eberle, J. A.; Hu, X.; Vassall, A. N.; Onda, M.; Beers, R.; Lee, E. C.; Kreitman, R. J.; Lee, B.; Baker, D., Recombinant immunotoxin for cancer treatment with low immunogenicity by identification and silencing of human T-cell epitopes. Proceedings of the National Academy of Sciences 2014, 201405153.

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22. Chew, W. L., Immunity to CRISPR Cas9 and Cas12a therapeutics. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine 2018, 10 (1), e1408.

 

 

 

 

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